目前检测犬冠状病毒(CCV)抗体的方法有蚀斑减数中和试验、微量血清中和试验、ELISA、间接荧光抗体技术(IFA)等［1～3］。中和试验以其敏感、特异、稳定等特点为国内外学者所公认，但中和试验所需时间长，操作复杂，不利于大规模样品的检测及基层单位使用。为此进行了本研究。
1 材料与方法
1.1 种毒与细胞 CCV NL-18参考株与CRFK细胞，引自美国，由本室殷震院士惠赠；犬肾(DK)传代细胞，由加拿大多伦多大学Compell博士惠赠；细胞生长液，为含10%新生犊牛血清的MEM培养液，维持液中不含新生犊牛血清，MEM为Sigma公司产品。
1.2 血清 CCV阳性对照血清，由本室保存，中和抗体效价为1∶500；CCV阴性对照血清，为本室保存的健康犬血清，中和抗体效价低于1∶4；待检犬血清，采自黑龙江、吉林、内蒙等地未注射CCV疫苗的犬。
1.3 包被抗原的制备 将CCV NL-18株接种于已形成单层的DK细胞，常规培养，待细胞出现病变并脱落后，将病毒培养液以3 000 r/min离心30 min，弃上清。未脱落的细胞用分散液(胰酶-EDTA混合分散液)从培养瓶中消化下来，3 000 r/min离心30 min，弃上清。将上述2 种方法获得的细胞混合物，加入0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(NaHCO31.59 g, Na2CO3 2.93 g/L,pH9.6)，细胞计数后，保存于-20℃冰箱中。阴性抗原采用正常细胞，经消化后按上述同样方法制备。
1.4 固定条件的筛选 取阳性抗原包被酶联反应板，各反应孔中的包被量相同。选择甲醇、乙醇、10%甲醛、10%乙醇+4%冰醋酸作为固定剂分别加入到反应孔中，加入量为0.05 mL/孔。固定时间选择5 、15、30、60、120 min，以未固定的病毒抗原作为对照。同时，以阴性细胞包被反应板，取上述固定剂固定，固定时间选择30 min，以未固定的阴性细胞作为对照。测定阳性对照血清的间接ELISA结果。
1.5 阳性血清的判定标准与OD值界限的筛选 利用阳性、阴性抗原包被酶联反应板，选择中和抗体阳性、阴性血清，测定其不同稀释度的间接ELISA结果。
1.6 间接ELISA术式 将保存的病毒抗原融化，以0.05 mol/L碳酸盐缓冲液稀释，加入到酶联反应板孔内，0.05 mL/孔，吹干，每孔加入0.05 mL的固定液固定。用0.01 mol/L PBS-Tween冲洗3次，每次3 min，犬血清经PBS稀释后，加入到反应孔中，0.05 mL/孔。将反应板置于37℃恒温箱中1 h，按上述方法洗3次。再加入经PBS稀释的HRP-SPA(上海欣生公司产品，工作浓度为1∶40)，0.05 mL/孔，置37℃感作1 h，冲洗3次。加入底物溶液0.1 mL/孔。底物溶液为含50 mL 0.1 mol/L柠檬酸，50 mL 0.2 mol/L Na2HPO4，40 mg邻苯二胺(OPD)和0.015 mL 30%H2O2。常温避光显色30 min后，加入2 mol/L H2SO4，0.05 mL/孔，终止反应。利用酶联反应检测仪(上海产)在492 nm处测量反应孔的光密度(OD)。
1.7 CCV中和试验 采用固定病毒-稀释血清法。将采集的新鲜犬血液常温下放置1 h，血液充分自凝后，5 000 r/min离心30 min，过滤除菌。将血清2倍系列稀释10个稀释度，分别加入等量固定浓度为100 TCID50的病毒悬液，置37℃感作1 h后，接种于已形成良好CRFK细胞单层的培养板，每孔0.1 mL，每个稀释度加4孔，37℃吸附1 h。每孔再加维持液0.9 mL，置37℃、60%～80%湿度、5%CO2条件下继续培养4 d，以试验孔出现多核巨细胞作为未保护标准，按改进的Reed-Muench法计算血清中和效价，以中和效价不低于1∶4作为CCV抗体阳性的判定标准。
2 结果
2.1 包被抗原收获时间 利用不同时间收获的病毒作为抗原分别包被酶反应板，测定标准阳性血清的间接ELISA结果(以OD值表示，见图1)。可以看出，随着收毒时间的延长，测定的OD值逐渐升高。4 d和5 d收获的病毒抗原所测定的OD值最高。本试验在制备包被抗原时将收毒时间确定为4 d。
应用间接ELISA检测犬冠状病毒抗体