3.3 固定条件 包被的病毒抗原经甲醇固定后，一方面可以降低非特异性反应。利用阴性抗原包被酶联反应板测定阳性对照血清的OD值，固定后的抗原所测定的结果显著低于未固定的抗原所测定的结果。甲醇作为有机溶剂，可以溶解部分脂类及蛋白成分，减少此类物质与血清中的IgG发生非特异性吸附。另一方面，可以提高与阳性血清发生特异反应的能力。CCV隶属于冠状病毒科，是单链正股RNA病毒，病毒蛋白质的合成发生于聚核蛋白体上，核衣壳的装配发生在胞浆的病毒工厂(毒浆)内，并在内质网和高尔基体的囊状膜上出芽成熟，且在此时附加囊膜突起。甲醇作为有机溶剂，可以提高细胞膜的通透性，使抗原位点暴露，增强抗原与抗体的结合能力［6］。试验中还发现，常用固定剂乙醇对CCV的固定效果不及甲醇和甲醛，其原因有待进一步探讨。
3.4 阳性血清的判定标准与OD值界限 本试验证实，间接ELISA与中和试验检测CCV抗体效价的结果具有相关性，但在中和抗体效价低的样品利用2种方法测得的结果差别较大。部分中和抗体阳性血清呈现较低的ELISA效价，部分中和抗体阴性血清的ELISA效价偏高。这一方面是非特异性反应的原因，同时也与阳性血清的判定标准有关。本试验在确定阳性标准时，选择的对照血清例数少，经统计学处理后的结果与实际标准的误差增加。另外，本试验是利用HRP标记SPA作为第2抗体参与反应，SPA与犬IgG的Fc片段结合力强，而与IgM的结合力尚未确定，中和试验却可以检测出犬感染CCV后早期IgM的变化。在实际检测时，可以适当提高阳性血清的判定标准，这样虽然可能由于阳性标准的提高而造成漏检，但却可以保证该方法的特异性。此外，如果用抗γ-球蛋白的酶标抗体代替HRP-SPA，就有可能检出低水平的抗体和感染初期的抗体［7］。OD值的界限也与间接ELISA的结果有关。以OD值0.2作为阳性界限，20倍稀释的中和抗体阴性血清有可能出现间接ELISA阴性，将0.3作为阳性界限，低效价中和抗体阳性血清又可能出现ELISA阴性，从而造成漏检。确定的标准应在扩大检测数，以及利用CCV人工感染试验查明保护犬免受CCV攻击的最低抗体水平的试验中加以探讨。
应用间接ELISA检测犬冠状病毒抗体